他们的生意很早就受到了牵制。由于京华的迅速崛起，特别是在闽海海盗联军被京华舰队一举歼灭之后，葡萄牙人提前享受了“缴纳过路费”的待遇。
但即便是要缴纳过路费，葡萄牙人依然对这条贸易线保持了极大的兴趣。一来是因为京华的过路费收得并不算苛刻，葡萄牙人的生意利润又足够大，完全没有理由放弃。二来则是因为天主教的传播问题。
葡萄牙船来航日本后数年，即日本天文18年(公元1549年)，天主教传到日本。第一个来到日本的传教士是西班牙的耶酥会士方济各·沙勿略。他于1549年到达日本后，先在鹿儿岛，继在山口、丰后传教，也到过平户、界和京都，两年后离开日本。日本人称他传入的天主教为“切支丹”或“吉利支丹”(葡萄牙语cristao的音译)。
众所周知，耶酥会是当时欧洲天主教会中反对宗教改革、帮助封建统治者镇压人民并向外殖民的重要工具。来到亚洲和拉美各地的耶酥会士有一部分以宗教家身分充当欧洲殖民者的急先锋，沙勿略就是这样一个传教士。
他在写给本国耶酥会的信中说，他来日本传教是“为把日本人的灵魂从恶魔手里拯救出来交给神”，要把日本人变成葡萄牙国王和西班牙国王的“忠实臣民”。外出传教的耶酥会士同样也是派遣国贸易商人的先遣队——这一点从前不久的马尼拉谈判中还有各大教团代表参加也看得出来。
沙勿略在1549年11月5日从鹿儿岛寄给住在印度果阿一名神甫的信中写道：“我把在同界通商时特别重要的商品表一并寄来，承办神甫们出航的人如果带来表中所列商品的话，将获巨量金银。”
于是，继沙勿赂之后，天主教传教士纷沓而至。他们以协助大名获得巨额贸易利益和满足大名置办武器的要求为诱饵，同某些大名勾结起来，使那些大名接受洗礼，成为教徒，从而获得了在这些大名领地内传教的权利。
接受洗礼的大名当时被称为“切支丹大名”，如丰后的大友宗腆、肥前的有马晴信、大村纯忠等，就是最初的这类大名。
大村纯忠为确保其贸易利益，在天正8年(1580年)时，竟将领地长崎及附近的茂木地区捐献给耶酥会作为领地。这一举动有使长崎沦为印度的果阿那样殖民地的危险，但无人能劝他打消这种做法。
大友、大村和有马这三个大名甚至为表示对罗马教宗的虔敬，于天正10年(1582年)派出一个少年使节团(“天正遣欧使节”)赴罗马，目前尚未回国
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